薄層色譜法實(shí)驗(yàn)操作方法

薄層色譜法實(shí)驗(yàn)流程

薄層色譜法系將供試品溶液點(diǎn)于薄層板上队伟，在展開容器內(nèi)用展開劑展開，使供試品所含成分分離幽勒，所得色譜圖與適宜的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)按同法所得的色譜圖對(duì)比嗜侮，亦可用薄層色譜掃描儀進(jìn)行掃描，用于鑒別啥容、檢查或含量測(cè)定锈颗。

1.儀器與材料

（1）薄層板  按支持物的材質(zhì)分為玻璃板、塑料板或鋁板等咪惠；按固定相種類分為硅膠薄層板击吱、鍵合硅膠板、微晶纖維素薄層板遥昧、聚酰胺薄層板覆醇、氧化鋁薄層板等。固定相中可加入黏合劑炭臭、熒光劑永脓。硅膠薄層板常用的有硅膠 G、硅膠 GF254鞋仍、硅膠 H常摧、硅膠 HF254，G威创、H 表示含或不含石膏黏合劑落午，F(xiàn)254 為在紫外光 254nm 波長(zhǎng)到紫外線燈下顯綠色背景的熒光劑。按固定相粒徑大小分為普通薄層板（10~40μm）和高效薄層板（5~10μm）那婉。

　　在保證色譜質(zhì)量的前提下板甘，可對(duì)薄層板進(jìn)行特別處理和化學(xué)改性以適應(yīng)分離的要求，可用實(shí)驗(yàn)室自制的薄層板详炬。固定相顆粒大小一般要求粒徑為 10~40μm盐类。玻板應(yīng)光滑寞奸、平整，洗凈后不附水珠在跳。

　∏固选（2）點(diǎn)樣器  一般釆用微升毛細(xì)管或手動(dòng)、半自動(dòng)猫妙、全自動(dòng)點(diǎn)樣器材瓷翻。

　　（3）展開容器  上行展開一般可用適合薄層板大小的專用平底或雙槽展開缸割坠，展開時(shí)須能密閉齐帚。水平展開用專用的水平展開槽。

　”撕摺（4）顯色裝置  噴霧顯色應(yīng)使用玻璃噴霧瓶或?qū)Ｓ脟婌F器对妄，要求用壓縮氣體使顯色劑呈均勻細(xì)霧狀噴出；浸漬顯色可用專用玻璃器械或用適宜的展開缸代用敢朱；蒸氣熏蒸顯色可用雙槽展開缸或適宜大小的干燥器代替剪菱。

　　（5）檢視裝置  為裝有可見光拴签、254nm 及 365nm 紫外光光源及相應(yīng)的濾光片的紫外觀察箱孝常，可附加攝像設(shè)備供拍攝圖像用。紫外觀察箱暗箱內(nèi)光源應(yīng)有足夠的光照度蚓哩。

　」咕摹（6）薄層色譜掃描儀  系指用一定波長(zhǎng)的光對(duì)薄層板上有吸收的斑點(diǎn)，或經(jīng)激發(fā)后能發(fā)射出熒光的斑點(diǎn)岸梨，進(jìn)行掃描冻押，將掃描得到的譜圖和積分?jǐn)?shù)據(jù)用于物質(zhì)定性或定量的分析儀器。

用于薄層色譜的紫外觀察箱盛嘿、薄層分析用紫外線燈箱

薄層色譜法操作方法

　　（1）薄層板制備

　　市售薄層板  臨用前一般應(yīng)在 110℃ 活化 30 分鐘括袒。聚酰胺薄膜不需活化次兆。鋁基片薄層板、塑料薄層板可根據(jù)需要剪裁锹锰，但須注意剪裁后的薄層板底邊的固定相層不得有破損芥炭。如在存放期間被空氣中雜質(zhì)污染，使用前可用三氯甲烷恃慧、甲醇或二者的混合溶劑在展開缸中上行展開預(yù)洗园蝠，晾干，110℃ 活化痢士，置干燥器中備用彪薛。

　　自制薄層板  除另有規(guī)定外，將 1 份固定相和 3 份水（或加有黏合劑的水溶液，如 0.2%~0.5%羥甲基纖維素鈉水溶液善延，或?yàn)橐?guī)定濃度的改性劑溶液）在研缽中按同一方向研磨混合少态，去除表面的氣泡后，倒入涂布器中易遣，在玻板上平穩(wěn)地移動(dòng)涂布器進(jìn)行涂布（厚度為 0.2~0.3mm）彼妻，取下涂好薄層的玻板，置水平臺(tái)上于室溫下晾干后豆茫，在 110℃ 烘 30 分鐘侨歉，隨即置于有干燥劑的干燥箱中備用。使用前檢查其均勻度揩魂，在反射光及透視光下檢視幽邓，表面應(yīng)均勻、平整肤京、光滑颊艳，并且無麻點(diǎn)、無氣泡忘分、無破損及污染棋枕。

　　（2）點(diǎn)樣  除另有規(guī)定外妒峦，在潔凈干燥的環(huán)境中重斑，用專用毛細(xì)管或配合相應(yīng)的半自動(dòng)、自動(dòng)點(diǎn)樣器械點(diǎn)樣于薄層板上肯骇。一般為圓點(diǎn)狀或窄細(xì)的條帶狀窥浪，點(diǎn)樣基線距底邊 10~15mm，高效板一般基線離底邊 8~10mm笛丙。圓點(diǎn)狀直徑一般不大于 4mm漾脂，高效板一般不大于 2mm。接觸點(diǎn)樣時(shí)注意勿損傷薄層表面胚鸯。條帶狀寬度一般為 5~10mm骨稿，高效板條帶寬度一般為 4~8mm，可用專用半自動(dòng)或自動(dòng)點(diǎn)樣器械噴霧法點(diǎn)樣姜钳。點(diǎn)間距離可視斑點(diǎn)擴(kuò)散情況以相鄰斑點(diǎn)互不干擾為宜坦冠，一般不少于 8mm，高效板供試品間隔不少于 5mm哥桥。

　≌藁搿（3）展開  將點(diǎn)好供試品的薄層板放入展開缸中，浸入展開劑的深度為距原點(diǎn) 5mm 為宜拟糕，密閉判呕。除另有規(guī)定外倦踢，一般上行展開 8~15cm，高效薄層板上行展開 5~8cm佛玄。溶劑前沿達(dá)到規(guī)定的展距硼一，取出薄層板，晾干梦抢，待檢測(cè)般贼。

　　展開前如需要溶劑蒸氣預(yù)平衡，可在展開缸中加入適量的展開劑奥吩，密閉哼蛆，一般保持 15~30 分鐘。溶劑蒸氣預(yù)平衡后霞赫，應(yīng)迅速放入載有供試品的薄層板腮介，立即密閉，展開端衰。如需使展開缸達(dá)到溶劑蒸氣飽和的狀態(tài)叠洗，則須在展開缸的內(nèi)壁貼與展開缸高、寬同樣大小的濾紙旅东，一端浸入展開劑中灭抑，密閉一定時(shí)間，使溶劑蒸氣達(dá)到飽和再如法展開抵代。

　　必要時(shí)腾节，可進(jìn)行二次展開或雙向展開，進(jìn)行第二次展開前荤牍，應(yīng)使薄層板殘留的展開劑完全揮干案腺。

　　（4）顯色與檢視  有顏色的物質(zhì)可在可見光下直接檢視康吵，無色物質(zhì)可用噴霧法或浸漬法以適宜的顯色劑顯色劈榨，或加熱顯色，在可見光下檢視晦嵌。有熒光的物質(zhì)或顯色后可激發(fā)產(chǎn)生熒光的物質(zhì)可在紫外線燈（365nm 或 254nm）下觀察熒光斑點(diǎn)鞋既。對(duì)于在紫外光下有吸收的成分，可用帶有熒光劑的薄層板（如硅膠 GF254 板）耍铜，在紫外光燈（254nm）下觀察熒光板面上的熒光物質(zhì)淬滅形成的斑點(diǎn)。

　〉啊（5）記錄  薄層色譜圖像一般可采用攝像設(shè)備拍攝棕兼，以光學(xué)照片或電子圖像的形式保存。也可用薄層色譜掃描儀掃描或其他適宜的方式記錄相應(yīng)的色譜圖抵乓。

　　3.系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

　　按各品種項(xiàng)下要求對(duì)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行系統(tǒng)適用性試驗(yàn)伴挚，即用供試品和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對(duì)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行試驗(yàn)和調(diào)整靶衍，應(yīng)符合規(guī)定的要求。

　【ビ蟆（1）比移值（Rf）  系指從基線至展開斑點(diǎn)中心的距離與從基線至展開劑前沿的距離的比值颅眶。

　　除另有規(guī)定外，雜質(zhì)檢查時(shí)田弥，各雜質(zhì)斑點(diǎn)的比移值 Rf 以在 0.2~0.8 之間為宜涛酗。

　　（2）檢出限  系指限量檢查或雜質(zhì)檢查時(shí)偷厦，供試品溶液中被測(cè)物質(zhì)能被檢出的低濃度或量商叹。一般采用已知濃度的供試品溶液或?qū)φ諛?biāo)準(zhǔn)溶液，與稀釋若干倍的自身對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)溶液在規(guī)定的色譜條件下只泼，在同一薄層板上點(diǎn)樣剖笙、展開、檢視请唱，后者顯清晰可辨斑點(diǎn)的濃度或量作為檢出限弥咪。

　　（3）分離度（或稱分離效能）  鑒別時(shí)十绑，供試品與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)色譜中的斑點(diǎn)均應(yīng)清晰分離聚至。當(dāng)薄層色譜掃描法用于限量檢查和含量測(cè)定時(shí)，要求定量峰與相鄰峰之間有較好的分離度孽惰，分離度(R)的計(jì)算公式為：

　　R=2(d2-d1)/(W1+W2)

　　式中 d2 為相鄰兩峰中后一峰與原點(diǎn)的距離晚岭；

　　d1 為相鄰兩峰中前一峰與原點(diǎn)的距離；

　　W1 及 W2 為相鄰兩峰各自的峰寬勋功。

　　除另有規(guī)定外坦报，分離度應(yīng)大于 1.0。

　　在化學(xué)藥品雜質(zhì)檢查的方法選擇時(shí)狂鞋，可將雜質(zhì)對(duì)照品用供試品自身稀釋的對(duì)照溶液溶解制成混合對(duì)照溶液片择，也可將雜質(zhì)對(duì)照品用待測(cè)組分的對(duì)照品溶液溶解制成混合對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)溶液，還可釆用供試品以適當(dāng)?shù)慕到夥椒ǐ@得的溶液骚揍，上述溶液點(diǎn)樣展開后的色譜圖中字管，應(yīng)顯示清晰分離的斑點(diǎn)。

　⌒挪弧（4）相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差  薄層掃描含量測(cè)定時(shí)嘲叔，同一供試品溶液在同一薄層板上平行點(diǎn)樣的待測(cè)成分的峰面積測(cè)量值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)不大于 5.0%；需顯色后測(cè)定的或者異板的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)不大于 10.0%抽活。

　　4.測(cè)定法

　×蚋辍（1）鑒別  按各品種項(xiàng)下規(guī)定的方法，制備供試品溶液和對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)溶液下硕，在同一薄層板上點(diǎn)樣丁逝、展開與檢視汁胆，供試品色譜圖中所顯斑點(diǎn)的位置和顏色（或熒光）應(yīng)與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)色譜圖的斑點(diǎn)一致。必要時(shí)化學(xué)藥品可采用供試品溶液與標(biāo)準(zhǔn)溶液混合點(diǎn)樣霜幼、展開嫩码，與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)相應(yīng)斑點(diǎn)應(yīng)為單一、緊密斑點(diǎn)罪既。

　≈狻（2）限量檢查與雜質(zhì)檢查  按各品種項(xiàng)下規(guī)定的方法，制備供試品溶液和對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)溶液萝衩，并按規(guī)定的色譜條件點(diǎn)樣回挽、展開和檢視。供試品溶液色譜圖中待檢查的斑點(diǎn)與相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)斑點(diǎn)比較猩谊，顏色（或熒光）不得更深千劈；或照薄層色譜掃描法操作，測(cè)定峰面積值牌捷，供試品色譜圖中相應(yīng)斑點(diǎn)的峰面積值不得大于標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的峰面積值墙牌。含量限度檢查應(yīng)按規(guī)定測(cè)定限量。

　　化學(xué)藥品雜質(zhì)檢查可釆用雜質(zhì)對(duì)照法暗甥、供試品溶液的自身稀釋對(duì)照法或兩法并用喜滨。供試品溶液除主斑點(diǎn)外的其他斑點(diǎn)與相應(yīng)的雜質(zhì)對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)溶液或系列濃度雜質(zhì)對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)溶液的相應(yīng)主斑點(diǎn)比較，不得更深撤防，或與供試品溶液自身稀釋對(duì)照溶液或系列濃度自身稀釋對(duì)照溶液的相應(yīng)主斑點(diǎn)比較虽风，不得更深。通常應(yīng)規(guī)定雜質(zhì)的斑點(diǎn)數(shù)和單一雜質(zhì)量寄月，當(dāng)釆用系列自身稀釋對(duì)照溶液時(shí)辜膝，也可規(guī)定估計(jì)的雜質(zhì)總量。

　⊙埂（3）含量測(cè)定  照薄層色譜掃描法厂抖，按各品種項(xiàng)下規(guī)定的方法，制備供試品溶液和對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)溶液克懊，并按規(guī)定的色譜條件點(diǎn)樣忱辅、展開、掃描測(cè)定谭溉∏蕉或?qū)⒋郎y(cè)色譜斑點(diǎn)刮下經(jīng)洗脫后，再用適宜的方法測(cè)定扮念。

5.薄層色譜掃描法

　　系指用一定波長(zhǎng)的光照射在薄層板上损搬，對(duì)薄層色譜中可吸收紫外光或可見光的斑點(diǎn)，或經(jīng)激發(fā)后能發(fā)射出熒光的斑點(diǎn)進(jìn)行掃描，將掃描得到的圖譜及積分?jǐn)?shù)據(jù)用于鑒別场躯、檢查或含量測(cè)定÷眉罚可根據(jù)不同薄層色譜掃描儀的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)踢关，按照規(guī)定方式掃描測(cè)定，一般選擇反射方式粘茄，采用吸收法或熒光法签舞。除另有規(guī)定外，含量測(cè)定應(yīng)使用市售薄層板柒瓣。

　　掃描方法可采用單波長(zhǎng)掃描或雙波長(zhǎng)掃描儒搭。如采用雙波長(zhǎng)掃描，應(yīng)選用待測(cè)斑點(diǎn)無吸收或小吸收的波長(zhǎng)為參比波長(zhǎng)芙贫，供試品色譜圖中待測(cè)斑點(diǎn)的比移值（Rf 值）搂鲫、光譜掃描得到的吸收光譜圖或測(cè)得的光譜大吸收和小吸收應(yīng)與對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)溶液相符，以保證測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性磺平。薄層色譜掃描定量測(cè)定應(yīng)保證供試品斑點(diǎn)的量在線性范圍內(nèi)魂仍，必要時(shí)可適當(dāng)調(diào)整供試品溶液的點(diǎn)樣量，供試品與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)同板點(diǎn)樣拣挪、展開擦酌、掃描、測(cè)定和計(jì)算菠劝。

　　薄層色譜掃描用于含量測(cè)定時(shí)赊舶，通常采用線性回歸二點(diǎn)法計(jì)算，如線性范圍很窄時(shí)赶诊，可用多點(diǎn)法校正多項(xiàng)式回歸計(jì)算笼平。供試品溶液和對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)溶液應(yīng)交叉點(diǎn)于同一薄層板上，供試品點(diǎn)樣不得少于 2 個(gè)甫何，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)每一濃度不得少于 2 個(gè)出吹。掃描時(shí)，應(yīng)沿展開方向掃描辙喂，不可橫向掃描捶牢。

上圖：用于薄層色譜的雙波長(zhǎng)紫外線燈LEAC-280L