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如何選擇合適熒光蛋白陵霉?

作者:上海峰志儀器 時間:2020-05-02 09:57:49瀏覽968 次

信息摘要:

在我們選擇熒光蛋白時,首要考慮的是熒光蛋白的聚合性質(zhì)伍绳,即是否會影響目的蛋白的功能及定位踊挠,其次是熒光蛋白的 PK 值是否與目的蛋白所處的環(huán)境的 pH 值相匹配,然后是熒光蛋白的成熟時間以及目的蛋白的壽命冲杀,綜合兩者決定熒光蛋白是否合適效床,zui后考慮熒光蛋白的光穩(wěn)定性、密碼子偏好性是否合適权谁,zui后考慮目的蛋白放的位置剩檀,熒光蛋白是否會影響目的蛋白的功能及定位。

自 1992 年綠色熒光蛋白被用于標(biāo)記基因旺芽,各種顏色的熒光蛋白被開發(fā)出沪猴,目前有上百種的熒光蛋白。在我們的實(shí)驗中采章,經(jīng)常會用到熒光蛋白运嗜,但是如何選擇合適熒光蛋白,得到完美的實(shí)驗結(jié)果悯舟?相信這個問題一直困擾著大家担租,鑒于此,小編從不同的角度去考慮如何選擇熒光蛋白抵怎,希望可以給大家在選擇熒光蛋白方面提供一些幫助翩活。
單體性質(zhì)將熒光蛋白與目標(biāo)蛋白進(jìn)行融合表達(dá)阱洪,直接地追蹤目標(biāo)蛋白或是定位目標(biāo)蛋白便贵,這就要求熒光蛋白是單體菠镇,不能影響目標(biāo)蛋白的功能和定位。因此承璃,我們將熒光蛋白的單體性質(zhì)放在位利耍。

目前體外檢測熒光蛋白單體性質(zhì)的方法有分子篩、沉降平衡盔粹,可以通過熒光蛋白分子篩的峰圖是否狹窄隘梨,單一粗略的判斷其是否為單體,沉降平衡能夠更加準(zhǔn)確的確認(rèn)其聚合性質(zhì)舷嗡。我們使用熒光蛋白幾乎都是在細(xì)胞內(nèi)或組織內(nèi)轴猎,因此我們更加關(guān)心在生理條件下,熒光蛋白的聚合性質(zhì)进萄。

科學(xué)家巧妙地將熒光蛋白與細(xì)胞色素 P450 進(jìn)行融合表達(dá)捻脖,讓熒光蛋白定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的胞質(zhì)面,熒光蛋白的聚合性質(zhì)會使鄰近的熒光蛋白聚合在一起中鼠,形成聚集體可婶,在激光共聚焦顯微鏡下能夠看到細(xì)胞核的周圍有很大的點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)。小編已經(jīng)用此種方法檢測了多個熒光蛋白援雇。

綠色熒光蛋白(GreenFluorescent Protein矛渴,簡稱GFP)是在美國西北海岸所盛產(chǎn)的一種名為Aequorea victoria的水母中發(fā)現(xiàn)的一種可以發(fā)出綠色熒光的蛋白質(zhì)。GFPzui早是在1962年由日本科學(xué)家下村修發(fā)現(xiàn)惫搏,是由238氨基酸組成的單體蛋白質(zhì)具温,蛋白分子量約為27kD。GFP的晶體結(jié)構(gòu)顯示筐赔,蛋白質(zhì)中央是一個圓柱形水桶樣結(jié)構(gòu)铣猩,長420nm,寬240nm川陆,由11個圍繞中心α螺旋的反平行β折疊組成剂习,桶的頂部由3個短的垂直片段覆蓋,底部由一個短的垂直片段覆蓋较沪,對熒光活性很重要的生色團(tuán)則位于桶的大空腔內(nèi)鳞绕。實(shí)驗表明GFP熒光產(chǎn)生的前提是桶狀結(jié)構(gòu)完整性,去除N端6個氨基酸或C端9個氨基酸尸曼,GFP均會失去熒光们何。原因是GFP生色團(tuán)的形成效率較低,而且形成過程受外界環(huán)境影響較大控轿。

發(fā)光原理:
GFP的第65至67位的三個氨基酸(絲氨酸-酪氨酸-甘氨酸)殘基冤竹,可自發(fā)地形成一種熒光發(fā)色團(tuán)拂封。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)鏈折疊時,這段被深埋在蛋白質(zhì)內(nèi)部的氨基酸片段鹦蠕,得以“親密接觸”冒签,導(dǎo)致經(jīng)環(huán)化形成咪唑酮,并發(fā)生脫水反應(yīng)钟病。在分子氧存在的條件下萧恕,發(fā)色團(tuán)可進(jìn)一步發(fā)生氧化脫氫,zui終成熟肠阱,形成可發(fā)射熒光的形式票唆。具體過程為:在 O2存在下,GFP分子內(nèi)第67位甘氨酸的酰胺對第65位絲氨酸的羧基進(jìn)行親核攻擊屹徘,形成第5位碳原子咪唑基走趋;第66位酪氨酸的α2β鍵脫氫反應(yīng)之后,導(dǎo)致芳香團(tuán)與咪唑基結(jié)合噪伊,并zui終自發(fā)催化形成對羥基苯甲酸咪唑環(huán)酮生色簿煌。

GFP需要在氧化狀態(tài)下產(chǎn)生熒光,強(qiáng)還原劑能使GFP轉(zhuǎn)變?yōu)榉菬晒庑问剿盅纾坏┲匦卤┞对诳諝饣蜓鯕庵欣舶桑珿FP熒光便立即得到恢復(fù)。一般來說弱還原劑并不會影響GFP熒光拙寡,中度氧化劑如生物材料的固定授滓,脫水劑戊二酸或甲醛等對GFP熒光影響也不大。

發(fā)光特性:
GFP吸收的光譜zui大峰值為395nm(紫外)肆糕,并有一個峰值為470nm的副吸收峰(藍(lán)光)般堆;發(fā)射光譜zui大峰值為509nm(綠光),并帶有峰值為540nm的側(cè)峰(Shouder)诚啃。雖然450~490nm只是GFP的副吸收峰淮摔,但由于該激發(fā)光對細(xì)胞的傷害更小,因此通常多使用該波段光源(多為488nm)始赎。此外和橙,GFP的光譜特性與熒光素異硫氰酸鹽(FITC)很相似,兩者通常共有一套濾光片造垛。GFP熒光極其穩(wěn)定魔招,在激發(fā)光照射下,GFP抗光漂白(Photobleaching)能力比熒光素強(qiáng)五辽,特別是在450~490nm藍(lán)光波長下更穩(wěn)定办斑。類似的,GFP融合蛋白的熒光靈敏度遠(yuǎn)比熒光素標(biāo)記的熒光抗體高,抗光漂白能力強(qiáng)乡翅,因此更適用于定量測定與分析鳞疲。由于GFP熒光的產(chǎn)生不需要任何外源反應(yīng)底物,因此GFP作為一種廣泛應(yīng)用的活體報告蛋白蠕蚜,其作用是任何其它酶類報告蛋白無法比擬的尚洽。但因為GFP不是酶,熒光信號沒有酶學(xué)放大效果波势,因此GFP靈敏度可能低于某些酶類報告蛋白翎朱,比如螢火蟲熒光素酶等。

變體:
在GFP發(fā)現(xiàn)的半個世紀(jì)中尺铣,陸續(xù)衍生了多個變體,其中zui的要屬其紅移變體——增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(enhanced GFP争舞,EGFP凛忿;EGFP的zui大吸收峰位于488nm)。其他還包括發(fā)射熒光也發(fā)生改變的變體竞川,包括藍(lán)色熒光蛋白:EBFP店溢,EBFP2,Azurite委乌,mKalama床牧;青色熒光蛋白:ECFP,Cerulean遭贸,CyPet戈咳;黃色熒光蛋白:YFP,Citrine壕吹,Venus著蛙,YPet等等

小編發(fā)現(xiàn)綠色熒光蛋白中,單體性質(zhì)比較好的是 mEmerald耳贬,該蛋白很少形成大的點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)踏堡,并且目前還沒有稱該蛋白會影響定位的報道。
此外 mEmerald 是一個非常穩(wěn)定的綠色熒光蛋白咒劲,因此可以用于線性的結(jié)構(gòu)光照明超分辨熒光顯微成像顷蟆。

我們還發(fā)現(xiàn)紅色熒光蛋白中沒有一個單體性質(zhì)特別好,相比較來說腐魂,mApple 的單體性質(zhì)zui好帐偎,但是在使用該蛋白的過程中,發(fā)現(xiàn) mAppple 會影響某些蛋白的定位挤渔,因此在使用紅色熒光蛋白時肮街,要謹(jǐn)記紅色熒光蛋白可能會影響目標(biāo)蛋白的定位。

PK 值每個熒光蛋白都有其zui合適的 pH 值判导,即在一定的 pH 值下嫉父,熒光強(qiáng)度zui高沛硅。有的熒光蛋白適合在酸性環(huán)境下使用,相反有的適合在堿性環(huán)境下使用绕辖,因此在選擇熒光蛋白時需要考慮熒光蛋白的 PK 值摇肌。
在細(xì)胞內(nèi),大多數(shù)細(xì)胞器內(nèi)及細(xì)胞質(zhì)的 pH 值都在 7.0 左右仪际,然而溶酶體內(nèi)的 pH 值就比較低围小,因此常規(guī)的熒光蛋白并不適合用于標(biāo)記溶酶體內(nèi)的蛋白。

mCherry 的 PK 值比較低树碱,適合在酸性的環(huán)境下使用肯适,可以用于標(biāo)記溶酶體內(nèi)的蛋白,但是該熒光蛋白有一定的二聚性質(zhì)成榜,可能會影響目標(biāo)蛋白的定位框舔,在使用該熒光蛋白時要綜合考慮單體性質(zhì)和 PK 值。

在選擇熒光蛋白時赎婚,要考慮目標(biāo)蛋白定位環(huán)境的 pH 值刘绣,再考慮使用相應(yīng) PK 值的熒光蛋白。同時也可以考慮利用熒光蛋白的 PK 值的特性挣输,幫助我們解決問題纬凤。

成熟時間熒光蛋白在發(fā)光之前需要經(jīng)歷轉(zhuǎn)錄、翻譯撩嚼、折疊等步驟停士,其中折疊過程占據(jù)了大部分時間,我們將此過程稱之為成熟時間绢馍。在標(biāo)記短壽命的目標(biāo)蛋白時向瓷,如果熒光蛋白的成熟時間太長,可能會出現(xiàn)在目標(biāo)蛋白開始降解時舰涌,熒光蛋白還沒有發(fā)光猖任,導(dǎo)致無法追蹤及定位目標(biāo)蛋白。因此在選擇熒光蛋白時瓷耙,需要考慮其成熟時間朱躺。

小編在實(shí)驗時發(fā)現(xiàn),mEmerald搁痛、Dendra2 的成熟時間比較快长搀,在用 Lipo2000 轉(zhuǎn)染試劑盒轉(zhuǎn)染 U2OS 細(xì)胞時,轉(zhuǎn)染后四個小時就能夠用熒光顯微鏡觀察到了熒光信號鸡典,EGFP 沒有信號源请。但是在用 P450 方法檢測時,Dendra2 會形成很大的聚集,表明該熒光蛋白的單體性質(zhì)不好谁尸,有可能影響目標(biāo)蛋白的定位和功能舅踪,在使用該蛋白的過程中應(yīng)該注意這個特性。

為了能夠更早地觀察某些短壽命熒光蛋白的生理特性和定位情況良蛮,科學(xué)家正在發(fā)展成熟時間更快的熒光蛋白抽碌,并且用于超分辨成像。

光穩(wěn)定性熒光蛋白在發(fā)光的同時會被漂白决瞳,逐漸失去發(fā)光能力货徙,因此要想獲得更多的信息,就需要熒光的光穩(wěn)定性好皮胡。在普通的熒光成像中痴颊,對熒光蛋白的光穩(wěn)定性要求并不是很高,比如激光共聚焦顯微鏡成像時胸囱,熒光信號的穩(wěn)定性只需要能保證采集的完整的一張圖即可祷舀。

在超分辨熒光成像中,對熒光蛋白的光穩(wěn)定性要求比較高烹笔。線性結(jié)構(gòu)光照明顯微鏡要求熒光蛋白始終處于亮的狀態(tài),需要通過結(jié)構(gòu)光采集多幅圖進(jìn)行重構(gòu)抛丽;非線性結(jié)構(gòu)光顯微鏡則要求熒光蛋白在黑亮之間進(jìn)行多次切換谤职,這就要求熒光蛋白能進(jìn)行反復(fù)的光調(diào)控,并且依舊維持著高的亮度亿鲜;與非線性結(jié)構(gòu)光顯微鏡一樣允蜈,可逆飽和光線性熒光轉(zhuǎn)移顯微鏡也要求熒光蛋白能夠在黑亮之間進(jìn)行反復(fù)的光調(diào)控。

優(yōu)化密碼子大多數(shù)熒光蛋白是來自于海洋生物蒿柳,因此密碼子偏好性與所要標(biāo)記蛋白的物種有較大的差異饶套,這種密碼子偏好性差異可能會導(dǎo)致熒光蛋白在哺乳動物細(xì)胞或組織中的表達(dá)量極低,以至于看不到熒光信號垒探。

幸運(yùn)的是大多數(shù)熒光蛋白的密碼子已經(jīng)經(jīng)過優(yōu)化妓蛮,適合在哺乳動物細(xì)胞中進(jìn)行融合表達(dá)。但是當(dāng)需要使用熒光蛋白在其他種屬細(xì)胞內(nèi)表達(dá)時圾叼,應(yīng)考慮一下密碼子偏好性蛤克。

小編在進(jìn)行線蟲熒光成像時,就遇到過此類問題夷蚊,沒有優(yōu)化密碼子時构挤,熒光蛋白的表達(dá)量比較弱,在熒光蛋白經(jīng)過密碼密碼子優(yōu)化惕鼓,并且在 DNA 序列之間插入線蟲的內(nèi)含子后筋现,熒光蛋白的表達(dá)量得到了較大的提高。

在比較少見的物種進(jìn)行熒光成像時,需要把密碼子優(yōu)化這個特性考慮在內(nèi)矾飞。

N 端或 C 端在選擇了相應(yīng)的熒光蛋白后一膨,我們需要確定把目標(biāo)蛋白放在熒光蛋白的 N 端或是 C 端。N 端與 C 端的區(qū)別在于目的蛋白凰慈,有的目的蛋白對這個要求不高汞幢,但某些目的蛋白就要求在特定的位置進(jìn)行融合表達(dá)。

熒光蛋白與目的蛋白融合表達(dá)可能會影響目的蛋白的折疊微谓,這取決于目的蛋白折疊過程中森篷,熒光蛋白所在的那一端有沒有參與蛋白質(zhì)的折疊。

例如豺型,如果目的蛋白的 C 端會被折疊入目的蛋白的內(nèi)側(cè)仲智,那么我們把熒光蛋白標(biāo)記在目的蛋白的 C 端,將獲得不到熒光信號姻氨;有些目的蛋白在后翻譯的過程會切掉一段钓辆,如果熒光蛋白處于被切的一端,那么就不能獲得準(zhǔn)確的目的蛋白的定位信息肴焊。

如果標(biāo)記的目的蛋白是一個新的蛋白前联,我們建議分別進(jìn)行 N 端和 C 端融合表達(dá),以此來確定哪一個是zui好的選擇娶眷。除此之外似嗤,還可以用免疫熒光來確認(rèn)目的蛋白定位是否與熒光蛋白融合表達(dá)的一致。

綜合以上的介紹届宠,在我們選擇熒光蛋白時烁落,首要考慮的是熒光蛋白的聚合性質(zhì),即是否會影響目的蛋白的功能及定位豌注,其次是熒光蛋白的 PK 值是否與目的蛋白所處的環(huán)境的 pH 值相匹配伤塌,然后是熒光蛋白的成熟時間以及目的蛋白的壽命,綜合兩者決定熒光蛋白是否合適轧铁,zui后考慮熒光蛋白的光穩(wěn)定性每聪、密碼子偏好性是否合適,zui后考慮目的蛋白放的位置属桦,熒光蛋白是否會影響目的蛋白的功能及定位熊痴。

此外,在進(jìn)行熒光成像時聂宾,需要考慮顯微鏡所選的濾光片是否與相應(yīng)的熒光蛋白質(zhì)配套果善,顯微鏡的各種參數(shù)是否合適。值得提醒的是系谐,激發(fā)光的強(qiáng)度不能太高巾陕,否則會導(dǎo)致熒光信號的漂白讨跟。

 

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