紫外激發(fā)光源激發(fā)植物GFP發(fā)光

紫外激發(fā)光源研究植物GFP發(fā)光

綠色熒光蛋白（green fluorescent protein早抠，GFP）在收到紫光外或者藍(lán)光激發(fā)時(shí)，發(fā)射綠色熒光撬讽，可在各種異源細(xì)胞蕊连，如細(xì)菌/昆蟲以及植物細(xì)胞中表達(dá)，在植物研究中游昼，通常需要各種顯微鏡來確定該基因是否表達(dá)甘苍，偶爾也會因?yàn)橹参镒园l(fā)熒光導(dǎo)致假陽性的誤判。

觀察GFP發(fā)光可用上海峰志實(shí)驗(yàn)室藍(lán)光手電筒LUYOR-3280RB烘豌，紫外線激發(fā)光源LUYOR-3280UV载庭，顯微鏡熒光激發(fā)光源LUYOR-3420照射植物，同時(shí)需要佩戴專用的熒光觀察眼鏡,使用遮光片觀察效果更佳廊佩。GFP熒光反應(yīng)用熒光顯微鏡甚至肉眼就可以觀察到囚聚，且靈敏度高，對于單細(xì)胞水平的表達(dá)也可識別标锄。

綠色熒光蛋白在紫外線的激發(fā)下發(fā)光

GFP是從水母分離出的一種天然熒光蛋白顽铸，分子量約27000。為一個(gè)由238個(gè)氨基酸殘基組成的單鏈多肽料皇，其熒光發(fā)射峰在509nm谓松，zui大激發(fā)波長為395 nm，并在470 nm處有一肩峰践剂，GFP的化學(xué)性質(zhì)相當(dāng)穩(wěn)定鬼譬，其變性需在90℃或pH<4．0或pH>12．0的條件下用6mol／L鹽酸胍處理。GFP的熒光發(fā)光有兩個(gè)明顯的吸收帶逊脯，對應(yīng)于GFP的兩種不同構(gòu)象的基態(tài)A和B优质。基態(tài)A對應(yīng)于395nm的吸收峰男窟，基態(tài)B對應(yīng)于475nm的吸收峰盆赤，基態(tài)A占優(yōu)勢，基態(tài)B的分子數(shù)量約是基態(tài)A的1／6歉眷，兩種基態(tài)間能緩慢地轉(zhuǎn)換牺六，但激發(fā)態(tài)A 之間的轉(zhuǎn)換很快且發(fā)生了質(zhì)子轉(zhuǎn)移，A 快速高效地衰變至另一激發(fā)態(tài)汗捡，應(yīng)該存在一個(gè)中間過度態(tài)I淑际，質(zhì)子轉(zhuǎn)移使A 轉(zhuǎn)變成I 畏纲，I 回遷到基態(tài)I時(shí)產(chǎn)生發(fā)射峰504nm的熒光，構(gòu)象改變使I 轉(zhuǎn)變成B 春缕，由B到B發(fā)射熒光而不發(fā)生質(zhì)子轉(zhuǎn)移盗胀。目前，對于GFP的作用機(jī)理較為認(rèn)同的僅僅是：GFP是生物發(fā)光過程中的能量受體锄贼，并且是zui終的發(fā)光體票灰，不同的生物發(fā)光機(jī)制各不相同，不同的突變體發(fā)光機(jī)制也有很大差異宅荤。

圖一：紅色熒光蛋白在LUYOR-3415RG激發(fā)光源的激發(fā)下發(fā)光

除此之外屑迂，上海峰志實(shí)驗(yàn)室燈還可以用做以下用途：

1、 野外冯键、實(shí)驗(yàn)室原位測定GFP(綠色熒光蛋白)惹盼。

2、 應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因作物研究惫确。

3手报、 區(qū)別可遺傳性改良生物體和不可遺傳的改良生物體。

4改化、 用于基因表達(dá)的研究掩蛤。

5、 用于Rhodamine（紅色熒光染料）所袁、葉綠素盏档、熒光素的研究。

為什么藍(lán)光和紫外線激發(fā)光源能激發(fā)GFP發(fā)出綠色熒光燥爷？

綠光蛋白GFP吸收的光譜峰值為395nm（紫外）蜈亩，并有一個(gè)峰值為470nm的副吸收峰（藍(lán)光）；雖然450～490nm只是GFP的副吸收峰前翎，但由于長波能量低稚配，細(xì)胞忍受能力強(qiáng)，更適合活體檢測港华，因此通常多使用藍(lán)光波段光源（多為488nm）道川。GFP發(fā)射光譜zui大峰值為509nm（綠光），并帶有峰值為540nm的側(cè)峰（Shouder）立宜。

圖二：LUYOR-3280UV紫外激發(fā)光源

為什么藍(lán)光和紫外線激發(fā)光源能激發(fā)GFP發(fā)出綠色熒光冒萄？

熒光蛋白GFP發(fā)光原理

熒光蛋白發(fā)光類型屬于斯托克斯位移型，其基本原理是生色團(tuán)在較高能量的光子照射下發(fā)生構(gòu)象的改變橙数，從而導(dǎo)致分子能級變化尊流，從高能級的構(gòu)象躍遷向低能級時(shí)發(fā)出較低能量的光子。生色團(tuán)在發(fā)光過程中主要有兩種化學(xué)過程灯帮。一是質(zhì)子轉(zhuǎn)移崖技，即質(zhì)子化和去質(zhì)子化逻住，二是分子構(gòu)象的改變。生色團(tuán)主要有三種構(gòu)象：A型迎献、B型以 及中間過渡態(tài)Z 型瞎访。在分子構(gòu)象變化的同 時(shí)還伴隨著氫鍵的生成和斷裂，以及電荷的傳遞去質(zhì)子化和質(zhì)子化的分子構(gòu)象不同吁恍， 對應(yīng)的分子能級也不同扒秸，從而其發(fā)射光譜中有兩個(gè)特征峰，代表兩種躍遷過程冀瓦。質(zhì)子化構(gòu)象生色基團(tuán)通過Tyr66 的脫質(zhì)子狀和質(zhì)子化狀態(tài)(酚羥基)的轉(zhuǎn)換決定熒光發(fā)射鸦采。由于酚的激發(fā)態(tài)酸性遠(yuǎn)大于其基態(tài), 故僅脫質(zhì)子態(tài)的結(jié)構(gòu)發(fā)射熒光。這個(gè)過程是十分迅速的咕幻，因此熒光蛋白發(fā)射的是熒光而不是磷光，需要激發(fā)光源持續(xù)存在才可連續(xù)發(fā)光顶霞。但是其極快的激發(fā)響應(yīng)使得熒光蛋白適合作為高靈敏度生物探針以及生物成像材料肄程。

圖三：LUYOR-3415RG激發(fā)光源照射煙草葉片的GFP發(fā)光

熒光蛋白GFP發(fā)光特性

GFP熒光極其穩(wěn)定，在激發(fā)光照射下选浑，GFP抗光漂白（Photobleaching）能力比熒光素強(qiáng)蓝厌，特別是在450～490nm藍(lán)光波長下更穩(wěn)定。在熒光顯微鏡下古徒，GFP融合蛋白的熒光靈敏度遠(yuǎn)比熒光素標(biāo)記的熒光抗體高拓提，抗光漂白能力強(qiáng)，因此更適用于定量測定與分析隧膘。由于GFP熒光的產(chǎn)生不需要任何外源反應(yīng)底物代态，因此GFP作為一種廣泛應(yīng)用的活體報(bào)告蛋白，其作用是任何其它酶類報(bào)告蛋白無法比擬的疹吃。但因?yàn)镚FP不是酶蹦疑，熒光信號沒有酶學(xué)放大效果，因此GFP靈敏度可能低于某些酶類報(bào)告蛋白萨驶，比如熒光蛋白的應(yīng)用非常的廣泛歉摧，已經(jīng)應(yīng)用于分子標(biāo)記，體內(nèi)示蹤腔呜，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)叁温，藥物篩選等生物科研的各個(gè)方面熒光讓我們能夠檢測分子的構(gòu)象變化，也能讓我們追蹤化學(xué)反應(yīng)…. 是科學(xué)研究的重要手段之一核畴。

熒光蛋白激發(fā)的日常用途

熒光蛋白+激發(fā)光源在生物基因研究中發(fā)揮著巨大的作用膝但，熒光蛋白在激發(fā)光源的激發(fā)下發(fā)出熒光，使得研究效果更直觀膛檀。以下為熒光蛋白的10個(gè)日常用途锰镀，本文為上海峰志摘錄娘侍，僅供參考。關(guān)于激發(fā)光源選擇泳炉，請咨詢上海峰志：網(wǎng)頁底部.

（1） Localization：可以放在目的基因的N端憾筏，也可以放在目的基因的C端。這樣的構(gòu)建方式可以幫助我們觀察到目的基因是什么時(shí)候開始表達(dá)以及在哪里表達(dá)花鹅；

（2） Transcription reporter：將熒光蛋白放在待研究啟動(dòng)子的后面氧腰，可以很好的觀察或者驗(yàn)證該啟動(dòng)子在特定細(xì)胞中的啟動(dòng)活性；

（3） FRET(Frster Resonance Energy Transfer):用來研究兩個(gè)不同的蛋白或者用一個(gè)蛋白的兩個(gè)不同結(jié)構(gòu)域之間的相互作用關(guān)系刨肃。通常是使用激發(fā)/發(fā)射光譜有重疊的兩個(gè)熒光蛋白古拴。目前蛋白-蛋白相互作用研究中zui廣泛應(yīng)用的FRET對就是青色熒光蛋白（cyan fluorescent protein, CFP）、黃色熒光蛋白（yellow fluorescent protein, YFP）真友。

（4） Split EGFP：FRET的另一種實(shí)現(xiàn)方法黄痪，同樣被用來研究蛋白與蛋白的相互作用。具體是將EGFP分割成兩部分盔然，分別融合到兩個(gè)蛋白桅打，當(dāng)兩個(gè)蛋白靠近時(shí)，EGFP的兩部分蛋白開始折疊愈案，成熟到發(fā)光挺尾。

（5） Biosensors：用來監(jiān)測細(xì)胞內(nèi)小生物分子或其他生理過程，比如AAV載體中的鈣指示劑站绪。

（6） Optogenetics：是研究人員使用一種新的光控方法選擇并打開了某種生物的一類細(xì)胞遭铺。光遺傳技術(shù)–21世紀(jì)神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域zui引人注目的革新，其主要原理是首先采用基因操作技術(shù)將光感基因（如ChR2恢准，eBR魂挂，NaHR3.0，Arch或OptoXR等）轉(zhuǎn)入到神經(jīng)系統(tǒng)中特定類型的細(xì)胞中進(jìn)行特殊離子通道或GPCR的表達(dá)馁筐。光感離子通道在不同波長的光照刺激下會分別對陽離子或者陰離子的通過產(chǎn)生選擇性锰蓬，從而造成細(xì)胞膜兩邊的膜電位發(fā)生變化，達(dá)到對細(xì)胞選擇性地興奮或者抑制的目的眯漩。

（7） Chemogenetics：利用遺傳學(xué)原理芹扭，以化學(xué)小分子為工具解決生物的問題，或通過干擾赦抖、調(diào)節(jié)正常生理過程了解蛋白質(zhì)的功能舱卡。

（8） In Vivo Imaging：活體成像系統(tǒng)成像原理包括生物發(fā)光與熒光兩種技術(shù)。生物發(fā)光是用熒光素酶基因標(biāo)記DNA队萤，利用其產(chǎn)生的蛋白酶與相應(yīng)底物發(fā)生生化反應(yīng)產(chǎn)生生物體內(nèi)的光信號;而熒光技術(shù)則采用熒光報(bào)告基因(GFP轮锥、RFP)或熒光染料(包括熒光量子點(diǎn))等新型納米標(biāo)記材料進(jìn)行標(biāo)記，利用報(bào)告基因產(chǎn)生的生物發(fā)光要尔、熒光蛋白質(zhì)或染料產(chǎn)生的熒光就可以形成體內(nèi)的生物光源舍杜。前者是動(dòng)物體內(nèi)的自發(fā)熒光新娜，不需要激發(fā)光源，而后者則需要外界激發(fā)光源的激發(fā)既绩。

（9） Cell marking/selection：大家做細(xì)胞實(shí)驗(yàn)概龄，通常都喜歡質(zhì)粒帶有熒光標(biāo)簽比如GFP，有了該熒光標(biāo)簽可以很方便的判斷質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率饲握。這種情況通常是熒光蛋白由另外一個(gè)不同的啟動(dòng)子控制或者由與目的基因相同的啟動(dòng)子控制但是通過IRES連接私杜。

（10） FACS：流式細(xì)胞分選技術(shù)，可以方便的分選出帶有熒光蛋白的細(xì)胞救欧，分選出的細(xì)胞可以進(jìn)行培養(yǎng)或其它處理衰粹，做更深的研究.

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